一、引言

细胞培养技术是细胞生物学、分子生物学、生物制药以及肿瘤研究等多个生命科学研究领域的核心实验方法之一。细胞传代（Passaging或Subculturing）是细胞培养中不可或缺的步骤，旨在维持细胞的正常生长状态、防止过度融合或凋亡，以及延长细胞生命周期。科学规范的传代操作直接影响实验数据的准确性和细胞系的稳定性。本文将系统性地介绍细胞传代的基本原理、准备工作、具体步骤、注意事项和常见问题处理，以期为科研人员提供详实的操作指南和理论支持。

二、细胞传代的基本原理

细胞在体外培养过程中，当其密度达到一定程度后会因接触抑制（Contact inhibition）而停止增殖，部分细胞可能进入衰老或凋亡状态。为了维持细胞活力并延续培养，需要定期进行传代，即将密集培养的细胞分散并转移到新的培养器皿中。通过传代操作，可以为细胞提供新的空间和养分，保持其稳定的生长状态和实验可重复性。根据细胞类型（贴壁细胞或悬浮细胞）、增殖速度及实验需求，传代周期和方法略有不同。

三、实验前准备

1. 无菌环境准备：所有传代操作必须在生物安全柜（Class II）中进行，以避免微生物污染。

2. 器材与耗材：准备移液枪、枪头、离心管、锥形瓶、细胞培养瓶、细胞刮、离心机等；所有耗材应为无菌、一次性使用。

3. 培养基：预热含有血清的完全培养基（通常37℃水浴预温），如DMEM、RPMI-1640等，视细胞类型而定。

4. 胰酶消化液：一般使用0.25%胰酶-EDTA，贴壁细胞传代时用以破坏细胞与基质之间的连接。

5. 细胞状态评估：通过倒置显微镜观察细胞密度、形态、污染情况，确保在良好状态下传代。

四、贴壁细胞传代操作步骤

以常见的贴壁细胞系（如HEK293、HepG2、A549）为例，其标准传代流程如下：

1. 去除旧培养基：将细胞培养瓶从培养箱中取出，于生物安全柜中倾倒旧培养基，移除代谢产物。

2. PBS清洗：加入适量无钙镁PBS，轻轻摇匀后倾倒，清除残留血清（血清中含胰酶抑制因子）。

3. 胰酶消化：加入适量0.25%胰酶-EDTA（约1ml/25cm²），置于37℃培养箱中消化1–3分钟。

4. 显微镜观察：待细胞边缘收缩、部分脱落时，取出敲击瓶壁助力脱附。

5. 加入培养基终止消化：加入2–3倍体积的完全培养基，充分吹打使细胞分散。

6. 收集细胞：吸入含细胞混悬液至离心管中，1000 rpm离心3–5分钟。

7. 重悬细胞：弃上清后加入新鲜培养基重悬细胞。

8. 接种新瓶：按1:3～1:5比例分装至新培养瓶，置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。

五、悬浮细胞传代操作步骤

悬浮细胞（如Jurkat、K562）不需消化酶，操作更为简便：

1. 混匀细胞：轻轻吹打或轻摇培养瓶，使细胞均匀悬浮。

2. 吸取细胞：按比例（如1:3）取一定量细胞液至新瓶。

3. 加入新鲜培养基至目标体积，混匀后继续培养。

4. 可定期计数细胞（使用台盼蓝染色法）控制密度，维持最佳生长状态（如2×10⁵～1×10⁶ cells/ml）。

六、传代比例与周期的确定

细胞的传代比例取决于其生长速度和密度。常规贴壁细胞的传代比例为1:3～1:5，快速增殖的细胞（如HeLa）可高达1:10。传代周期通常为2–4天，具体需根据显微镜观察结果调整。若细胞长至80–90%融合即为适宜传代时机。

七、操作注意事项

1. 保持无菌操作，严禁交叉污染；

2. 消化时间要适中，过长会伤害细胞，过短导致细胞无法脱附；

3. PBS清洗不能省略，可防止胰酶失活；

4. 细胞混匀要轻柔，避免机械剪切造成细胞损伤；

5. 定期检测微生物污染（支原体、真菌、细菌）；

6. 每3–5代应保存一份细胞冻存管，防止污染或变异。

八、常见问题与处理方法

1. 消化不全：可适当延长胰酶时间，并配合轻敲瓶壁；

2. 细胞贴壁差：可能因消化过度或胰酶未中和，应调整操作流程；

3. 细胞死亡率高：检查培养基是否变质，或是否存在污染；

4. 传代后生长缓慢：应关注细胞密度、代数是否过高、是否处于亚健康状态。

九、总结

细胞传代是维持细胞活性、开展实验的基础操作，涉及无菌技术、细胞生物学及实验设计的综合知识。科研人员应熟练掌握不同类型细胞的传代要点，严格执行标准化操作规程，确保实验结果的科学性和可重复性。随着细胞工程和自动化技术的发展，未来细胞传代也将趋于标准化、智能化，为生命科学研究提供更加可靠的支持。