HPLC检测服务
三、液相色谱仪的组成
液相色谱仪主要包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。
1 输液系统:
包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合HPLC要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小,通过柱子的流动相受到的流动阻力很大,因此需要高压泵输送流动相。
2 进样系统:
将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两项功能。
3 分离柱:
色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的HPLC微粒填料,如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。采用的固定相粒度甚至可以达到1μm,而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μm。HPLC填充柱效的理论值可以达到50000/m~160000/m理论板,一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。由于柱效内、外多种因素的影响,因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的死体积。
4 检测系统:
HPLC检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物(包括流动相和样品组分)的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器和磁光旋转检测器。这类检测器适用范围广,但是对于流动相有响应,受温度变化、流动相流速和组成变化的影响,检测灵敏度低,不能用于梯度洗脱的分离模式。专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感,可用于测量被分离组分某类特性的变化。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。
5 数据处理系统:
数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类,前者可以完成一般的色谱数据处理任务,有些软件可以实现部分仪器的控制功能。前者即一般的色谱工作站,后者通常称之为专家系统。
四、仪器、试剂:
主要仪器:岛津液相色谱仪(LC-20)、10μL微量注射器、滤膜
试剂:正己烷、异丙醇、待测样品
五、实验步骤:
- 准备
- 准备所需的流动相,用合适的0.45um滤膜过滤,超声脱气20min;
- 根据待检样品的需要选择并安装好合适的色谱柱;
- 配置样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的0.45um滤膜过滤;
- 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常;
- 开机:接通电源,依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器,带泵和检测器自检结束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。
- 参数设定
- 波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入波长值,按[enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕,也可以选择LC-solution 软件方便地设定;
- 流速设定:在A泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需的流速(柱在线时流速一般不超过1mL/min),按[enter]键确认。按[CE]键退出,也可以选择LC-solution 软件设定;
- 流动相比例设定:在A泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入流动相B的浓度百分数,按[enter]键确认。按[CE]键退出,也可在软件中设定。
- 更换流动相并排气泡
- 将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中,逆时针转动A/B泵的排液阀180o,打开排液阀,按A/B泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以9.9mL/min的流速冲洗,3min(可设定)后自动停止,将排液阀顺时针转到底,关闭排液阀,如管路中有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。
- 平衡系统
- 按A泵的[pump]键,A、B泵将同时启动,pump指示灯。用检验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相,观测泵控制屏幕上的压力值,压力波动应超过不超过1MPa。
- 观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为<0.001mV时,可认为系统已达到平衡系统,可以进样。
- 进样:将样品用滤膜过滤,用10uL玻璃注射器将样品液体从进样阀进样(注意,进样时,尽量不要让针头接触进样孔的壁),进好样后,进行测试,观察工作电脑桌面上液相曲线变化,测试完后停止进样,用电脑进行数据分析。
实验数据处理: